A plataforma de proteômica / espectrometria de massas do ICC oferece análises de espectrometria de massas (MS/MS) acoplada ou não à cromatografia líquida. As análises podem fornecer dados qualitativos e quantitativos de diversas moléculas, sendo a principal área de atuação da plataforma a proteômica baseada em espectrometria de massas.  As análises oferecidas podem auxiliar na compreensão do funcionamento de sistemas biológicos, na identificação de marcadores presentes em patologias e como metodologia analítica para controle de qualidade na produção de proteínas e compostos químicos.

Equipamentos:

1-Cromatógrafo líquido nanoLC Ultra 1D plus Eksigent / amostrador automático nanoLC as-2 Eksigent
2-Cromatógrafo líquido nLC Easy 1000 Thermo Scientific
3-Cromatógrafo líquido nanoAcquity Waters
Os cromatógrafos líquidos da plataforma suportam pressões de 10 a 15 mil psi, permitindo desta forma aplicações de UHPLC (ultra high performance liquid chromatography), na qual se usa colunas analíticas contendo partículas de C18 sub 2-microns. Isto oferece maior resolução na análise, ou seja, maior poder de separação entre as moléculas de uma determinada amostra.
4-Espectrômetro de massas LTQ Orbitrap XL ETD Thermo Scientific
O equipamento LTQ Orbitrap XL ETD é um espectrômetro de massas híbrido, ou seja, possui dois analisadores de massas, um analisador LTQ (linear transfer quadrupole) e um analisador orbitrap. A alta resolução (até 100.000) e acurácia de massa (sub-ppm) do orbitrap  somadas à velocidade do LTQ, acoplada à cromatografia UHPLC (ultra high performance liquid chromatography), permite em poucas horas a determinação da massa de milhares de moléculas e seus fragmentos (MS/MS) presentes em uma amostra. Para a proteômica, isto significa a possibilidade de identificação de milhares de proteínas em amostras complexas.

Documentos:
- Procedimento para utilização da Subunidade de Espectrometria de Massas – RPT02H
- Preparo de extrato proteico para análise proteômica
- SDS PAGE – coloração com prata e azul de Coomassie
- Digestão de proteínas em gel
- Digestão de proteínas em filtro - FASP
- Purificação de peptídeos em C18 StageTip

Dr. Fabricio Klerynton Marchini
fabricio.marchini@fiocruz.br

Dra. Kelly Cavalcanti Machado
kelly.machado@fiocruz.br

Dr. Michel Batista –
michel.batista@fiocruz.br

A Plataforma de Biologia Estrutural Integrada tem por objetivo fornecer infraestrutura e treinamento em todas as etapas do processo de resolução e análise estrutural de proteínas, desde sua produção recombinante, caracterização biofísica em solução, cristalização até a determinação de estruturas tridimensionais. Esta plataforma está estruturada em quatro subunidades principais: 

 1) Expressão de proteínas recombinantes em células eucarióticas – a implantação desta tecnologia visa disponibilizar a possibilidade de produção de proteínas complexas, multimodulares e oligoméricas para análise estrutural cuja expressão em conformação nativa não é possível em Escherichia coli ou outros sistemas bacterianos. Para estas atividades contamos com uma sala de cultivo para células eucarióticas equipada com uma incubadora de CO2 convencional (ThermoFisher), uma incubadora de CO2 com agitação (Multitron, Infors), uma cabine de segurança biológica, um microscópio invertido e um refrigerador/freezer duplex.

 2) Purificação de proteínas – além de equipamentos para ruptura de células e centrífugas, a plataforma está equipada com seis cromatógrafos (ex-GE Healthcare, atual Cytiva Healthcare).

 - 2 cromatógrafos ÄKTA UPC 100 (para operação em câmara refrigerada);

 - 2 cromatógrafos ÄKTA Pure M25 com válvula para quatro opções de entrada de tampões;

 - 1 cromatógrafo ÄKTA Pure M25 com bomba de injeção de amostras para uso com grandes volumes; 

- 1 cromatógrafo ÄKTA Pure M25 com válvula para quatro entradas de tampão e válvula para conexão múltipla de até cinco colunas. 

A plataforma também disponibiliza um conjunto limitado de colunas para cromatografia de exclusão molecular (gel-filtração).

 3) Caracterização biofísica e de interações moleculares – a infraestrutura disponível possibilita: a) a análise do conteúdo de estruturas secundárias e/ou análise de estabilidade por dicroísmo circular (CD); b) a análise de estabilidade e/ou estado de enovelamento por medidas de fluorescência; c) a realização de ensaios baseados em análise de luminescência (fluorescência ou quimio/bio luminescência; d) a determinação do raio hidrodinâmico e análise do estado de agregação por espalhamento dinâmico de luz (DLS); e) a determinação simultânea do estado de oligomerização/agregação e análise de desenovelamento utilizando DLS e varredura de fluorescência (nanoDSF); f) a determinação de constante de dissociação através da técnica de termoforese em microescala. 

Para estas análises contamos com os seguintes equipamentos:
- Espectrômetro de dicroísmo circular Jasco J-815;
- Espectrômetro de Luminescência LS-55 (Perkin Elmer): equipamento para detecção de fluorescência e quimio/bioluminescência, que opera na faixa espectral de 200 a 800 nm para excitação e 200 a 630 nm para emissão.
- Sistema de análise de espalhamento dinâmico de luz NanoStar (Wyatt Technologies);
- Sistema de nanoDSF/DLS Prometheus Panta (Nanotemper Technologies);
- Sistema de termoforese em microescala Monolith NT115 (Nanotemper Technologies), compatível com cromóforos com excitação/emissão em 450-495/505-575 nm (azul) e 595-645/665-730 nm (vermelho).

4) Cristalização e análise estrutural de proteínas – a plataforma tem capacidade para cristalização de proteínas incluindo testes iniciais e refinamento das condições de cristalização, análise de imagem automatizada das placas de cristalização e recursos computacionais para processamento de dados de difração e análise estrutural. Os dados de difração dos cristais são obtidos externamente, em estações experimentais de difração de raios-X de proteínas de laboratórios síncrotron. 

Os equipamentos disponíveis para estas atividades são:
- Robô pipetador de volumes submicrolitro para ensaios de cristalização (Mosquito, STP Labtech);
- Robô dispensador programável para pipetagem de volumes de 0,5 μL a 4 mL para preparação das combinações matriciais de soluções para otimização de cristais (Dragonfly, STP Labtech);
- Equipamento automatizado de análise de imagens (Rock Imager 2, Formulatrix).
- Microscópio ótico convencional para observação de cristais Olympus SZX16 com câmera de alta resolução acoplada;
- Três estações de trabalho de alta performance para processamento de dados e análise estrutural.  

Nilson Zanchin:  nilson.zanchin@fiocruz.br

 Beatriz Guimarães:  beatriz.guimaraes@fiocruz.br 

Tecnologistas
- Eloise Pavão Guerra Slompo
- Natalia Bueno
- Tatiana R. S. Assunção de Matos

A citometria de fluxo é uma técnica de análise e separação de células e partículas, baseada em características físicas, como tamanho e granulosidade, e propriedades funcionais, que podem ser analisadas simultaneamente. As propriedades funcionais correspondem a diversas moléculas e processos celulares, como marcadores intracelulares e extracelulares, proteínas, açúcares, DNA, potencial de membrana mitocondrial entre outros. A citometria de fluxo é uma técnica extremamente versátil, compatível com diversas amostras biológicas para analisar diversos processos biológicos.

A Subunidade de Citometria de Fluxo da Rede de Plataforma Tecnológicas da Fiocruz (RPT08L) (RPT08L) presta serviços para a comunidade científica, operando os citômetros, adquirindo os dados. Também oferece consultoria técnico-científica, auxiliando no desenvolvimento de projetos com citometria de fluxo.  Além disso, a subunidade capacita colaboradores internos do ICC, que utilizarão a tecnologia de forma intensa para desenvolver o projeto de pesquisa, assim, estes colaboradores podem operar os equipamentos e realizarem os ensaios de forma autônoma.

A disciplina de Citometria de Fluxo no Programa de Pós-graduação em Biociências e Biotecnologia do Instituto Carlos Chagas é oferecida pela subunidade. Alunos de outros programas de pós-graduação podem cursar a disciplina, de acordo com as normas da Pós-graduação em Biociências e Biotecnologia.

Citômetros:

FACS Aria II:

• 2 lasers (488 nm e 633 nm)
• 9 parâmetros (tamanho, granulosidade e 7 fluorescências - Tabela 1)
• 4 opções de nozzle e pressão
• Cell sorting asséptico
• Separação celular em até 4 populações. Sorting em tubos, placas e lâminas
• Sistema de contenção de aerossóis (Aerosol Management Option)
• Sistema de coleta de amostras em câmera refrigerada (Lauda)

            FACS Canto II

• 3 lasers (488nm, 633nm e 405nm)
• 10 parâmetros (tamanho, granulosidade e 8 fluorescências - Tabela 2)
• Sistema para leitura de amostras em placas de 96 poços (HTS)

            Outros equipamentos:

1. Cabine de segurança biológica classe II tipo A1
2. Centrífuga para tubos de 1,5 mL
3. Geladeira
4. Vortex

Priscila Mazzocchi Hiraiwa
priscila.hiraiwa@fiocruz.br

Rodrigo Netto Costa
rodrigo.netto@fiocruz.br